Pregabalin nije agonist GABAA ili GABAB receptora.
Pregabalin je gabapentinoid i djeluje tako da inhibira određene kalcijeve kanale. Konkretno, on je ligand pomoćnog mjesta α2δ podjedinice određenih kalcijevih kanala ovisnih o naponu (VDCC), i stoga djeluje kao inhibitor VDCC-a koji sadrže α2δ podjedinicu. Postoje dvije α2δ podjedinice koje se vežu za lijek, α2δ-1 i α2δ-2, a pregabalin pokazuje sličan afinitet za (a time i nedostatak selektivnosti između) ta dva mjesta. Pregabalin je selektivan u vezivanju za α2δ VDCC podjedinicu. Unatoč činjenici da je pregabalin analog GABA-e, ne veže se na GABA-receptore, ne pretvara se u GABA-u ili neki drugi agonist GABA-receptora in vivo i ne modulira izravno transport ili metabolizam GABA-e. Međutim, utvrđeno je da pregabalin proizvodi povećanje ekspresije L-glutaminske kiseline dekarboksilaze (GAD) u mozgu ovisno o dozi, enzima odgovornog za sintezu GABA-e, te stoga može imati neke neizravne GABA-ergičke učinke povećanjem razine GABA-e u mozgu. Trenutno nema dokaza da su učinci pregabalina posredovani bilo kojim drugim mehanizmom osim inhibicije VDCC-a koji sadrže α2δ. U skladu s tim, čini se da je inhibicija VDCC-a koji sadrže α2δ-1 pregabalinom odgovorna za njegove antikonvulzivne, analgetske i anksiolitičke učinke.
Endogene α-aminokiseline L-leucin i L-izoleucin, koje po kemijskoj strukturi vrlo nalikuju pregabalinu i drugim gabapentinoidima, očiti su ligandi α2δ VDCC podjedinice sa sličnim afinitetom kao gabapentinoidi (npr. IC50 = 71 nM za L- izoleucin), a prisutni su u ljudskoj cerebrospinalnoj tekućini u mikromolarnim koncentracijama (npr. 12,9 μM za L-leucin, 4,8 μM za L-izoleucin). Postoji teorija da bi oni mogli biti endogeni ligandi podjedinice i da mogu kompetitivno antagonizirati učinke gabapentinoida. U skladu s tim, dok gabapentinoidi poput pregabalina i gabapentina imaju nanomolarne afinitete za α2δ podjedinicu, njihove su potencije in vivo u niskom mikromolarnom rasponu, a za ovu razliku vjerojatno je odgovorna konkurencija za vezanje endogenih L-aminokiselina.

U jednoj je studiji utvrđeno da pregabalin ima 6 puta veći afinitet od gabapentina za VDCC-ove koji sadrže α2δ podjedinicu. Međutim, drugo je istraživanje pokazalo da pregabalin i gabapentin imaju slične afinitete za ljudsku rekombinantnu podjedinicu α2δ-1 (Ki = 32 nM odnosno 40 nM). U svakom slučaju, pregabalin je 2 do 4 puta jači od gabapentina kao analgetik, a kod životinja se čini da je 3 do 10 puta jači od gabapentina kao antikonvulziv.