Pregabalin nije agonist GABAA ili GABAB receptora.
Pregabalin je gabapentinoid i djeluje tako da inhibira određene kalcijeve kanale.Točnije, to je ligand pomoćnog mjesta podjedinice α2δ određenih kalcijevih kanala ovisnih o naponu (VDCC), te stoga djeluje kao inhibitor VDCC-a koji sadrže α2δ podjedinicu.Postoje dvije α2δ podjedinice koje vežu lijek, α2δ-1 i α2δ-2, a pregabalin pokazuje sličan afinitet za (i stoga nedostatak selektivnosti između) ova dva mjesta.Pregabalin je selektivan u vezivanju na α2δ VDCC podjedinicu.Unatoč činjenici da je pregabalin analog GABA, on se ne veže na GABA receptore, ne pretvara se u GABA ili drugi agonist GABA receptora in vivo i ne modulira izravno GABA transport ili metabolizam.Međutim, utvrđeno je da pregabalin proizvodi dozu ovisno povećanje moždane ekspresije L-glutaminske kiseline dekarboksilaze (GAD), enzima odgovornog za sintezu GABA-e, te stoga može imati neke neizravne GABAergične učinke povećanjem razine GABA u mozgu.Trenutno nema dokaza da su učinci pregabalina posredovani bilo kojim drugim mehanizmom osim inhibicijom VDCC-a koji sadrže α2δ.U skladu s tim, čini se da je inhibicija VDCC-a koji sadrže α2δ-1 od strane pregabalina odgovorna za njegove antikonvulzivne, analgetske i anksiolitičke učinke.
Endogene α-amino kiseline L-leucin i L-izoleucin, koje po kemijskoj strukturi jako nalikuju pregabalinu i drugim gabapentinoidima, očiti su ligandi α2δ VDCC podjedinice sa sličnim afinitetom kao gabapentinoidi (npr. IC50 = 71 nM izoleucin), a prisutni su u ljudskoj cerebrospinalnoj tekućini u mikromolarnim koncentracijama (npr. 12,9 μM za L-leucin, 4,8 μM za L-izoleucin).Teoretizirano je da oni mogu biti endogeni ligandi podjedinice i da mogu kompetitivno antagonizirati učinke gabapentinoida.U skladu s tim, dok gabapentinoidi poput pregabalina i gabapentina imaju nanomolarne afinitete za α2δ podjedinicu, njihove su potencije in vivo u niskom mikromolarnom rasponu, a za ovu neusklađenost je vjerojatno odgovorna konkurencija za vezanje endogenih L-amino kiselina.

U jednoj studiji utvrđeno je da pregabalin posjeduje 6 puta veći afinitet od gabapentina za VDCC koji sadrže α2δ podjedinicu.Međutim, druga studija pokazala je da pregabalin i gabapentin imaju slične afinitete za ljudsku rekombinantnu α2δ-1 podjedinicu (Ki = 32 nM odnosno 40 nM).U svakom slučaju, pregabalin je 2 do 4 puta jači od gabapentina kao analgetik, a kod životinja se čini da je 3 do 10 puta jači od gabapentina kao antikonvulziva.